Isolée en 1960 [ 1], la lactoferrine appartient à la famille des transferrines : lactoferrines (Lf) et transferrines (Tf) fixent réversiblement deux ions ferriques et possèdent non seulement une structure primaire (59 % homologie) mais également une conformation spatiale très proches avec des sites de liaison du fer identiques. Elles diffèrent par leur charge de surface (pHi de 8,4-9 pour la Lf et de 5,4-5,9 pour la Tf) et la stabilité de la liaison protéine-fer [ 2]. En effet, la stabilité de fixation du fer ferrique en fonction du pH de la Lf est supérieure à celle de la Tf. Il faut en effet un pH inférieur à 2 pour dissocier le fer de la Lf, alors qu’un pH inférieur à 6 suffit à le dissocier de la Tf. Cette caractéristique, associée à une affinité pour le fer sensiblement supérieure à celle de la Tf à pH neutre, attribue un rôle de chélateur du fer à la Lf, plutôt que celui de transporteur du fer, propre à la Tf. Ces caractéristiques vont conférer à la Lf des fonctions qui lui sont propres (Figure 1) et, contrairement à la Tf, elle ne sera pas impliquée dans l’homéostasie martiale [ 3].

Figure 1. La lactoferrine : une protéine multifonctionnelle. Les rôles multiples de la lactoferrine sont regroupés en secteurs : rôles anti-microbiens, immunomodulateurs, anti-tumoraux, dans l’absorption du fer et dans la croissance osseuse.

Figure 1. La lactoferrine : une protéine multifonctionnelle. Les rôles multiples de la lactoferrine sont regroupés en secteurs : rôles anti-microbiens, immunomodulateurs, anti-tumoraux, dans l’absorption du fer et dans la croissance osseuse.

Synthétisée en continu par les épithéliums glandulaires, la Lf est présente dans le lait, les larmes, la bile, la salive et les sécrétions des organes reproducteurs et des tractus respiratoire et gastro-intestinal [ 4]. Elle est également synthétisée au cours de la différenciation des polynucléaires neutrophiles dans lesquels elle est stockée, ou par les cellules microgliales [ 5, 6]. La concentration sérique de Lf est faible, mais ce taux est augmenté lors de la dégranulation des neutrophiles qui conduit à une très forte accumulation de Lf sur le lieu de l’inflammation. La Lf humaine (hLf) est une glycoprotéine qui a pour caractéristique d’être hautement basique avec une distribution concentrée de ses charges positives dans le domaine aminoterminal et dans la région inter-lobe. La structure tridimensionnelle montre que ce polypeptide est structuré en deux lobes globulaires correspondant aux moitiés amino- et carboxy-terminales liées par une courte hélice a. Chaque lobe est structuré en deux domaines qui délimitent une crevasse profonde à l’intérieur de laquelle est situé le site de fixation du fer (Figure 2) [ 7, 8]. Le domaine amino-terminal est le siège des interactions de la Lf avec ses nombreux partenaires : glycosaminoglycanes (GAG), lipopolysaccharides (LPS), ADN et récepteurs, et par-là même, il intervient dans la majorité de ses activités biologiques [ 9]. Ces caractéristiques sont partagées par d’autres Lf, notamment par la Lf bovine (bLf), molécule la plus utilisée dans les essais in vitro et in vivo.

Figure 2. Structure tridimensionnelle de la lactoferrine. La structure tridimensionnelle présentée est celle d’une hLf saturée en fer montrant l’extrémité amino-terminale correspondant aux résidus 1GRRRR5 (données de diffraction aux rayons-X ; référence pdb 2BJJ) [17, 18]. A. La structure montre l’organisation bilobée de la molécule avec, en orange, les hélices α et, en vert, les feuillets β. Les acides aminés N-t et C-t sont indiqués. B. La structure montre l’organisation en 4 domaines de la Lf : N1 et N2, et C1 et C2 pour les lobes N-t et C-t, respectivement. Les sites de fixation du fer sont localisés aux interfaces entre chaque paire de domaines. C. La photo montre la surface accessible aux solvants de la molécule avec la distribution des charges positives (bleu) et négatives (rouge). La modélisation moléculaire a été réalisée en utilisant le programme Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/).

Figure 2. Structure tridimensionnelle de la lactoferrine. La structure tridimensionnelle présentée est celle d’une hLf saturée en fer montrant l’extrémité amino-terminale correspondant aux résidus 1GRRRR5 (données de diffraction aux rayons-X ; référence pdb 2BJJ) [17, 18]. A. La structure montre l’organisation bilobée de la molécule avec, en orange, les hélices α et, en vert, les feuillets β. Les acides aminés N-t et C-t sont indiqués. B. La structure montre l’organisation en 4 domaines de la Lf : N1 et N2, et C1 et C2 pour les lobes N-t et C-t, respectivement. Les sites de fixation du fer sont localisés aux interfaces entre chaque paire de domaines. C. La photo montre la surface accessible aux solvants de la molécule avec la distribution des charges positives (bleu) et négatives (rouge). La modélisation moléculaire a été réalisée en utilisant le programme Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/).

La Lf est un élément clef du système de défense inné de l’hôte et possède un large spectre antimicrobien qui s’étend des bactéries Gram- et Gram+, levures, champignons, à certains virus et protozoaires (Tableau I). Récemment, le groupe de Teng a fait une découverte primordiale en montrant que l’expression de la Lf pouvait être directement induite par un stimulus proinflammatoire : LPS ou ARN double brin, mimant une attaque virale [ 10].

Tableau I. Micro-organismes contre lesquels s’exerce l’activité anti-infectieuse des lactoferrines humaine et bovine ou des peptides naturels (Lfcine) ou synthétiques (Lfampine) issus de ces lactoferrines [9, 11, 12, 14, 15].

Tableau I. Micro-organismes contre lesquels s’exerce l’activité anti-infectieuse des lactoferrines humaine et bovine ou des peptides naturels (Lfcine) ou synthétiques (Lfampine) issus de ces lactoferrines [9, 11, 12, 14, 15].

Activité anti-bactérienne

La Lf est à la fois bactériostatique et bactéricide (pour revues voir [9, 11, 12]). Le principal mécanisme par lequel elle exerce son action bactériostatique est la privation en fer. Sécrétée dans les fluides biologiques sous une forme non saturée (apo-Lf), elle inhibe la croissance des bactéries par compétition avec les sidérophores bactériens pour la séquestration du fer libre. À côté de cette activité bactériostatique, la Lf exerce aussi une activité bactéricide indépendante de sa fonction de chélateur du fer. Par sa capacité à se fixer directement aux LPS, aux acides lipoteichoïques (molécules de la paroi bactérienne) ou aux porines, la Lf déstabilise la membrane des bactéries, provoque leur fragilisation et augmente leur perméabilité. L’activité bactéricide de la Lf passe également par l’inhibition de l’attachement des bactéries aux cellules hôtes. Ainsi, en se fixant aux GAG et intégrines de l’hôte, la Lf neutralise ces pathogènes dès les premiers stades de l’infection. La résistance aux antibiotiques de certaines bactéries peut être due au fait qu’elles sont capables de s’organiser en biofilm. Des études in vitro montrent que l’apo-Lf, en interagissant avec ces différentes molécules de surface, peut prévenir la formation de ces biofilms.

L’activité bactéricide de la Lf est concentrée dans la région aminoterminale fortement basique. Cette portion de la protéine peut être libérée sous l’action de la pepsine lors de la digestion. Le peptide antimicrobien produit est appelé lactoferricine (Lfcine) (Figure 3) [ 13]. Son activité bactériolytique à spectre large (Tableau I) est supérieure à celle de la Lf native, la Lfcine d’origine bovine (LfcineB) étant la plus active [14]. Ainsi, la Lf, en sacrifiant la majeure partie de sa chaîne polypeptidique, produit une arme antibactérienne beaucoup plus puissante qu’elle-même. L’efficacité des Lfcines fait que de nouveaux peptides antimicrobiens ont été élaborés et testés, notamment la lactoferrampine (Lfampine) [15].

Figure 3. Structure de la lactoferricine (Lfcine) et localisation du domaine Lfcine et de la séquence de la lactoferrampine (Lfampine) sur la Lf. La figure montre (A) le domaine LfcineB tel qu’il est conformé dans la bLf (résidus 17-41 ; référence pdb 1BLF) [25], et (B) le peptide de 25 résidus d’acides aminés de la LfcineB en solution aqueuse déterminé par spectroscopie RMN (référence pdb 1LFC) [26]. Les positions des acides aminés chargés positivement, hydrophobes et aromatiques, sont indiquées, ainsi que la position des résidus de Trp 19 et 21 dans la bLf. Les positions de la LfcineH (orange et rouge), de la LfcineB (orange) et de la LfampineB ou LfampineH (vert) sont montrées sur les vues de face (C, E) et de profil gauche (D, F) de la hLf. La représentation en ruban est montrée en C et D et celle de la surface de la molécule accessible aux solvants en E et F. La modélisation moléculaire a été réalisée en utilisant le programme Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/).

Figure 3. Structure de la lactoferricine (Lfcine) et localisation du domaine Lfcine et de la séquence de la lactoferrampine (Lfampine) sur la Lf. La figure montre (A) le domaine LfcineB tel qu’il est conformé dans la bLf (résidus 17-41 ; référence pdb 1BLF) [25], et (B) le peptide de 25 résidus d’acides aminés de la LfcineB en solution aqueuse déterminé par spectroscopie RMN (référence pdb 1LFC) [26]. Les positions des acides aminés chargés positivement, hydrophobes et aromatiques, sont indiquées, ainsi que la position des résidus de Trp 19 et 21 dans la bLf. Les positions de la LfcineH (orange et rouge), de la LfcineB (orange) et de la LfampineB ou LfampineH (vert) sont montrées sur les vues de face (C, E) et de profil gauche (D, F) de la hLf. La représentation en ruban est montrée en C et D et celle de la surface de la molécule accessible aux solvants en E et F. La modélisation moléculaire a été réalisée en utilisant le programme Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/).

Les données fournies par des études expérimentales et épidémiologiques montrent que les facteurs génétiques jouent un rôle primordial dans la susceptibilité aux infections. L’étude du polymorphisme du gène de la Lf montre effectivement l’existence de variants possédant des propriétés physicochimiques et biologiques spécifiques. Une analyse, réalisée chez des sujets atteints ou non de parodontite juvénile agressive, montre que les sujets non affectés possèdent un résidu lysine en position 29, alors que les sujets atteints possèdent en lieu et place un résidu arginine [ 16]. Le fait que le mutant Lf^K29R possède une plus grande activité bactéricide que la protéine native confirme qu’il existe bien une susceptibilité génétique à certains pathogènes.

La Lf est un puissant modulateur de la réponse inflammatoire protégeant l’organisme des agressions de pathogènes mais jouant également un rôle clef dans les pathologies inflammatoires [9, 20, 21].

Activité anti-inflammatoire

En interagissant avec les LPS et de nombreux récepteurs à la surface des cellules épithéliales et immunes, la Lf module la production de cytokines et le recrutement de cellules immunes au site de l’inflammation et protège ainsi du choc septique [9, 20, 21]. De nombreuses études chez l’animal montrent qu’une prise orale de bLf protège efficacement contre des doses létales de LPS. Le mécanisme d’action de cette protection est illustré par la Figure 4. La Lf, en diminuant l’environnement proinflammatoire, protège également contre certaines maladies : arthrite rhumatoïde, inflammation chronique de l’intestin, maladies neurodégénératives et allergie cutanée. De nombreuses études utilisant des modèles animaux d’inflammation expérimentale des différents tissus touchés montrent que l’administration orale de bLf réduit l’inflammation. Dans la plupart des cas, cette protection est également due à une diminution de la production de TNF-α (tumor necrosis factor) et l’IL(interleukine)-1β et une augmentation de l’IL-10. Cette modulation du processus inflammatoire passe également par une diminution du recrutement de cellules immunes, notamment des leucocytes.

Figure 4. La neutralisation des LPS par la lactoferrine protège du choc septique. Les LPS libérés dans la circulation sanguine s’associent à la LBP (LPS-binding protein) et au récepteur membranaire CD14 présent sur les monocytes et les macrophages. A. L’activation de ces cellules nécessitera l’interaction du complexe ternaire avec le récepteur TLR4 (cell-signalling Toll-like receptor 4). B. Les cellules endothéliales dépourvues de CD14 seront activées par la présentation au TLR4 du complexe LPS-LBP-CD14 soluble. Le CD14 soluble est produit soit par les cellules activées, soit par clivage enzymatique du CD14 membranaire. L’activation des monocytes/macrophages et des cellules endothéliales conduit à la production de cytokines proinflammatoires. Produites en quantités modérées, ces molécules ont un effet bénéfique mais, lorsque leur production est excessive, il en résulte des altérations tissulaires pouvant conduire au choc septique. L’action de ces cytokines sur les cellules endothéliales conduit également à une augmentation de l’expression des molécules d’adhérence dont les ligands sont portés par les neutrophiles et les monocytes. L’adhésion des neutrophiles, suivie de leur dissémination dans les tissus, joue un rôle majeur dans le processus inflammatoire. C. La Lf, en piégeant le LPS, inhibe la formation des différents complexes et s’oppose aux effets délétères du LPS, offrant ainsi une protection contre le choc septique [9, 20].

Figure 4. La neutralisation des LPS par la lactoferrine protège du choc septique. Les LPS libérés dans la circulation sanguine s’associent à la LBP (LPS-binding protein) et au récepteur membranaire CD14 présent sur les monocytes et les macrophages. A. L’activation de ces cellules nécessitera l’interaction du complexe ternaire avec le récepteur TLR4 (cell-signalling Toll-like receptor 4). B. Les cellules endothéliales dépourvues de CD14 seront activées par la présentation au TLR4 du complexe LPS-LBP-CD14 soluble. Le CD14 soluble est produit soit par les cellules activées, soit par clivage enzymatique du CD14 membranaire. L’activation des monocytes/macrophages et des cellules endothéliales conduit à la production de cytokines proinflammatoires. Produites en quantités modérées, ces molécules ont un effet bénéfique mais, lorsque leur production est excessive, il en résulte des altérations tissulaires pouvant conduire au choc septique. L’action de ces cytokines sur les cellules endothéliales conduit également à une augmentation de l’expression des molécules d’adhérence dont les ligands sont portés par les neutrophiles et les monocytes. L’adhésion des neutrophiles, suivie de leur dissémination dans les tissus, joue un rôle majeur dans le processus inflammatoire. C. La Lf, en piégeant le LPS, inhibe la formation des différents complexes et s’oppose aux effets délétères du LPS, offrant ainsi une protection contre le choc septique [9, 20].

La Lf se place également au carrefour de la régulation de processus cellulaires cruciaux que sont le cycle et la mort cellulaires. En exerçant un rôle de surveillance de la croissance des cellules, la Lf lutte contre la tumorigenèse et le développement de métastases, ce qui suggère que cette molécule pourrait jouer le rôle d’un suppresseur de tumeur. Les Lf native et recombinante, les Lfcines et la delta-lactoferrine (ΔLf), isoforme intracellulaire de la hLf, possèdent toutes une activité antitumorale [9, 14, 21, 23, 24].

Régulation de la croissance cellulaire

La Lf limite la croissance des cellules tumorales en induisant un arrêt du cycle cellulaire en G1/S. Cet arrêt est provoqué par un ensemble de processus qui gère la valse des cyclines et leur dégradation, la régulation par phosphorylation de kinases et la disponibilité des facteurs d’initiation de la transcription (Figure 5). La Lf est au cœur de cette régulation mais il est difficile de proposer une vue d’ensemble, les événements qu’elle contrôle ayant été étudiés dans des modèles cellulaires différents. Ainsi, la Lf inhibe la voie des MAP kinases dans les cellules MDAMB-231 (issues d’un adénocarcinome du sein humain) via une diminution des activités cdk2 (cyclin dependent kinase) et cdk4, et à une augmentation de l’expression de l’inhibiteur p21. Dans les cellules de carcinome du cou et de la tête, elle agit en activant la voie dépendante de p27/cycline E via la phosphorylation de AKT. Dans les cellules de carcinome du col de l’utérus, la Lf entraîne une surexpression du suppresseur de tumeur p53 via la voie NF-κB. La progression du cycle et la traduction d’acteurs cellulaires de la transition G1/S nécessitent la dissociation du complexe Rb-E2F par phosphorylation de Rb (protéine du rétinoblastome). La Lf, en induisant la surexpression de Rb, maintient une concentration élevée en Rb non phosphorylée et conduit donc à la rétention de E2F. La ΔLf provoque également un arrêt du cycle cellulaire via la surexpression des gènes Rb et Skp1. Skp1 appartient au complexe SCF (Skp1/Cullin/F-box) ubiquitine ligase responsable de la dégradation par le protéasome d’acteurs du cycle cellulaire de la transition G1/S.

Figure 5. La lactoferrine au carrefour entre prolifération et apoptose. Les protéines Rb et p53 jouent un rôle déterminant dans la régulation du cycle cellulaire. A. La progression du cycle repose sur l’activation du facteur de transcription E2F qui active les gènes dont l’expression est nécessaire à la phase S. Rb inhibe l’interaction de E2F avec le complexe d’initiation de la transcription, en se fixant sur son domaine d’activation. Le blocage de la progression du cycle cellulaire est réalisé par Rb sous forme non ou hypophosphorylée. Au cours de la phase G1, Rb est phosphorylée par la cycline D/cdk4 mais continue d’interagir avec E2F. Le changement de conformation du à cette phosphorylation favorise la seconde vague de phosphorylation par le complexe cycline E/cdk2, ce qui aura pour conséquence d’inactiver Rb, de libérer E2F et de déclencher la phase S. B. Le contrôle de l’intégrité cellulaire est aussi assuré par le facteur de transcription p53 qui active la transcription de nombreux acteurs du cycle cellulaire, dont l’inhibiteur p21 qui bloque la progression du cycle en se fixant sur n’importe quel complexe cycline/cdk, inhibant ainsi leur activité. Il y aura alors réparation ou apoptose. P53 activera également la transcription d’un facteur anti-angiogénique, la maspine et du facteur pro-apoptotique Bax. La Lf et la ΔLf vont toutes deux participer au contrôle du cycle et de la mort cellulaire. C. La Lf induit une surexpression de Rb qui s’accumule majoritairement sous forme hypophosphorylée conduisant à la rétention de E2F. La Lf peut également inhiber l’activité kinase de cdk4 et cdk2, activer l’expression de p53 et augmenter indirectement, mais spécifiquement, le niveau de l’inhibiteur de la kinase dépendante des cyclines p21. D. La ΔLf transactive les gènes Bax, Fas, Rb et Skp1. La protéine Skp1 appartient au complexe SCF à activité ubiquitine ligase responsable de la dégradation protéasomale de nombreux acteurs du cycle cellulaire de la transition G1/S.

Figure 5. La lactoferrine au carrefour entre prolifération et apoptose. Les protéines Rb et p53 jouent un rôle déterminant dans la régulation du cycle cellulaire. A. La progression du cycle repose sur l’activation du facteur de transcription E2F qui active les gènes dont l’expression est nécessaire à la phase S. Rb inhibe l’interaction de E2F avec le complexe d’initiation de la transcription, en se fixant sur son domaine d’activation. Le blocage de la progression du cycle cellulaire est réalisé par Rb sous forme non ou hypophosphorylée. Au cours de la phase G1, Rb est phosphorylée par la cycline D/cdk4 mais continue d’interagir avec E2F. Le changement de conformation du à cette phosphorylation favorise la seconde vague de phosphorylation par le complexe cycline E/cdk2, ce qui aura pour conséquence d’inactiver Rb, de libérer E2F et de déclencher la phase S. B. Le contrôle de l’intégrité cellulaire est aussi assuré par le facteur de transcription p53 qui active la transcription de nombreux acteurs du cycle cellulaire, dont l’inhibiteur p21 qui bloque la progression du cycle en se fixant sur n’importe quel complexe cycline/cdk, inhibant ainsi leur activité. Il y aura alors réparation ou apoptose. P53 activera également la transcription d’un facteur anti-angiogénique, la maspine et du facteur pro-apoptotique Bax. La Lf et la ΔLf vont toutes deux participer au contrôle du cycle et de la mort cellulaire. C. La Lf induit une surexpression de Rb qui s’accumule majoritairement sous forme hypophosphorylée conduisant à la rétention de E2F. La Lf peut également inhiber l’activité kinase de cdk4 et cdk2, activer l’expression de p53 et augmenter indirectement, mais spécifiquement, le niveau de l’inhibiteur de la kinase dépendante des cyclines p21. D. La ΔLf transactive les gènes Bax, Fas, Rb et Skp1. La protéine Skp1 appartient au complexe SCF à activité ubiquitine ligase responsable de la dégradation protéasomale de nombreux acteurs du cycle cellulaire de la transition G1/S.

Cette question n’a toujours pas trouvé de réponse claire. La hLf possède la capacité de se fixer à des séquences spécifiques d’ADN dont l’une d’entre elles s’est révélée être un élément de réponse fonctionnel. Elle possède, en plus de la séquence NLS (séquence de localisation nucléaire) conservée parmi les Lf de différentes espèces et fonctionnelle dans la ΔLf, une séquence NLS qui lui est propre et qui correspond aux résidus 1-5 amino-terminaux [ 29, 30]. Ces deux Lf ont été observées dans le noyau où elles exercent une activité de facteur de transcription activant pour la Lf le gène de l’IL-1β et pour la ΔLf les gènes Skp1, Rb, Bax, Fas et DcpS (decapping enzyme scavenger) [29, 31, 32]. La polémique tourne donc autour d’un problème d’adressage. Si la ΔLf cytoplasmique peut transiter aisément jusqu’au noyau, la Lf de sécrétion doit, après endocytose et avant son transfert au lysosome, emprunter une voie qu’il reste à découvrir pour accéder au noyau.

Le remodelage osseux est le fait d’une coopération étroite et précise entre les ostéoclastes qui détruisent le tissu osseux, et les ostéoblastes qui le reconstruisent [ 33]. La bLf stimule la prolifération des ostéoblastes in vitro en favorisant la croissance osseuse. Elle limite également la résorption osseuse en inhibant l’ostéoclastogenèse. Ces résultats sont encourageants, mais le mécanisme d’action reste encore à être élucidé. Néanmoins, la Lf semble jouer un rôle physiologique clef dans la formation osseuse et pourrait être un agent thérapeutique potentiel de la lutte contre l’ostéoporose [ 34].

Le rôle de la Lf dans l’absorption intestinale du fer est toujours un grand sujet de controverse. Si les nourrissons alimentés au lait maternel présentent moins de problèmes d’anémie que ceux qui sont nourris avec des laits maternisés, les nombreuses expériences de supplémentation des laits par la bLf tendent à démontrer que la Lf n’est pas impliquée dans ce processus [ 35]. Ces données ont été confirmées sur la base de modèles animaux et notamment les souris lf^−/−. En effet, les souriceaux issus d’un croisement de souris lf^−/− et de souris sauvages ne souffrent pas de l’absence de Lf dans le lait de leur mère [ 36]. Des travaux récents relancent la polémique puisqu’un récepteur de la Lf (intelectine) a été caractérisé à la surface de la muqueuse intestinale fœtale [ 37] et qu’une étude menée en parallèle sur 300 femmes enceintes ayant une anémie ferriprive montre qu’une prise orale de bLf entraîne une amélioration, voire la guérison de ces patientes [ 38].

La découverte de la Lf dans le lait maternel il y a soixante ans ne permettait pas d’imaginer qu’elle puisse posséder un tel potentiel thérapeutique. Ses nombreuses activités biologiques, dont la spécificité a parfois été mise en doute mais dont les effets ont souvent été clairement démontrés in vivo, et le fait qu’elle soit dépourvue de toxicité, font qu’elle suscite un intérêt industriel important dans les domaines agroalimentaire et pharmaceutique, et la classent parmi les alicaments. Cent tonnes de bLf sont purifiées et mises sur le marché chaque année. La hLf recombinante est produite dans différents micro-organismes et plantes, mais également directement dans le lait d’animaux transgéniques. Les applications sont nombreuses et de plus en plus d’essais cliniques sont réalisés afin de tester in vivo son efficacité en tant qu’agent anti-microbien, immunomodulateur et/ou anti-cancéreux.